實驗名稱：超聲激活血卟啉對S180腫瘤細(xì)胞表面EGFR表達(dá)量的影響

　　研究方向：生物醫(yī)療

　　測試目的：

血卟啉是從血紅蛋白中提取的有機光敏劑，其本身無抗腫瘤效應(yīng)，但它可以在動物和人的多種腫瘤組織優(yōu)先聚集，易為聲光輻射處理激活，當(dāng)它被聲光激活后能產(chǎn)生強烈的抗腫瘤效應(yīng)。美國利用光激活治療腫瘤，這種方法被稱為光動力學(xué)療法，簡稱PDT。光動力學(xué)療法在臨床主要應(yīng)用于人體表面淺層腫瘤的治療。光在生物組織中的穿透能力差，使其對深部腫瘤的治療受到限制。超聲聯(lián)合血卟啉對小鼠移植腫瘤生長抑制有協(xié)同效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)單用血卟啉無抑制作用，單用超聲僅有輕微抑制作用，而兩者聯(lián)合則有明顯的抑制效果，并將之命名為聲動力學(xué)療法。超聲是一種彈性機械波，其在生物組織中的穿透能力比激光強，同時超聲能夠聚焦于特定部位。聲動力療法對于治療腫瘤細(xì)胞有較強的針對性，對正常組織無創(chuàng)傷，組織穿透力強，并且機體不產(chǎn)生耐受性，可以反復(fù)多次治療，因而它對于治療腫瘤，特別是組織深層腫瘤有著較好的應(yīng)用前景。有學(xué)者認(rèn)為SDT殺死或抑制腫瘤細(xì)胞的部分機理是通過超聲的熱效應(yīng)來實現(xiàn)的，但是大量的實驗結(jié)果提示，SDT可能更主要地與超聲激活聚集在癌組織的血卟啉產(chǎn)生單線態(tài)氧有關(guān)。

　　測試設(shè)備：ATA-8202射頻功率放大器、昆明系小白鼠、艾氏腹水腫瘤細(xì)胞系、超聲探頭、血卟啉衍生物為單羥乙基單乙烯基次卟啉、細(xì)胞色素c和Bax單克隆抗體、caspase-3單克隆抗體、鏈霉卵白素SP試劑盒。

　　實驗過程：

　　接種：S180腹水瘤細(xì)胞于6只小鼠腹腔1周后，隨機取3只小鼠，抽取腹水細(xì)胞，分別置于醫(yī)用薄壁試管，加入RPMI1640+10%小牛血清培養(yǎng)基中，于37℃孵箱培養(yǎng)，實驗時用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至2x10⁶個/ml。每只小鼠抽取的腹水細(xì)胞分為12管，分為四組，分別為對照組(CT)、血卟啉組(H)、超聲組(U)和超聲加血卟啉組(UH)，每組三管，每管0.5ml細(xì)胞懸液。H組和UH組每管中加入血卟啉4ul，使其終濃度為0.01mg/ml，37℃CO₂孵箱孵育，45min后U組和UH組分別在頻率為1.8MHz，強度為2W/cm²的超聲裝置中聲照處理3min，各實驗組分別于聲照后1h、3h、5h取材，常規(guī)細(xì)胞涂片。

　　免疫組織化學(xué)染色：以SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：細(xì)胞涂片固定后加3%過氧化氫處理15min，除去內(nèi)源性酶PBS洗3次，加正常動物血清30min以減少非特異性染色，加EGFR一抗4℃過夜，PBS代替一抗作為陰性對照。SP染色按試劑盒說明進(jìn)行，DAB顯色，梯度酒精脫水，中性樹膠封固蓋片。

　　陽性結(jié)果觀察：各組隨機選取10個高倍視野，利用數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和分析。Image Pro-Plus5.0圖像分析軟件測定各組照片的平均光密度OD值(0~255)(用平均光密度表示陽性細(xì)胞表達(dá)強度，平均光密度值越大則表達(dá)越強)。組間t檢驗顯示組間差異。

　　實驗結(jié)果：

　　由表中數(shù)據(jù)可以看出，超聲激活血卟啉處理1h后，UH組、U組平均光密度值明顯低于CT組、H組，且UH組平均光密度值低于U組，經(jīng)組間t檢驗，UH組與其它組差異極顯著(p<0.01)；超聲激活血卟啉處理3h后，UH組平均光密度值小幅度下降，CT組、H組基本無變化，U組平均光密度下降，經(jīng)組間t檢驗，UH組與可組差異顯著(P<0.05)；UH組與CT組、H組差異極顯著(p<0.01)；超聲激活血卟啉處理5h后，UH組平均光密度值下降，其它組基本無變化，UH組與其它組差異極顯著(p<0.01)(表1)。由圖可知，UH組、U組平均光密度值明顯低于H組和CT組，隨時間延長U組、UH組變化顯著。

　　表1EGFR在超聲處理1h、3h、5h后平均光密度值比較(*10^-2)

　　圖1EGFR在超聲處理1h、3h、5h后平均光密度值比較(*10^-2)

　　安泰ATA-8202射頻功率放大器：

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