實驗名稱：聚焦超聲對S180腫瘤細胞膜理化性質的影響

　　研究方向：生物醫療

　　測試目的：

　　細胞膜是細胞生命活動中有著復雜功能的重要結構其基本作用在于維持細胞內外環境的相對穩定而其通透性、完整性及流動性等理化性質則與胞內外信息傳遞、物質能量交換等多種功能有著密切的關系?膜的有序結構影響著生命活動的正常進行。當細胞癌變后?癌細胞膜更新較快?比正常細胞更易受到外界環境的影響?因此成為近年來腫瘤細胞分子生物學研究的熱門領域。有實驗發現?超聲在處理細胞時?可促使細胞膜局部破裂?從而改變細胞質膜的通透性使胞內物質釋放或使胞外物質進入細胞?進而影響細胞執行正常的生理活動。超聲的作用機制一般包括：機械作用、熱效應和空化作用，有研究表明主要是超聲空化作用引起的機械剪切力和熱效應導致細胞膜改變，但其具體的作用機制并不清楚。因此本實驗采用超聲頻率為2.2MHz?篩選最佳的聲照強度及處理時間以作用于S180腫瘤細胞?通過檢測細胞內FD500的陽性染色率和熒光強度、乳酸脫氫酶釋放量及膜流動性的改變以研究超聲對S180細胞膜的損傷作用；并初步探討單純聚焦超聲造成這些改變的具體作用機制。

　　測試設備：ATA-8202射頻功率放大器、有流式細胞儀、熒光顯微鏡。

　　實驗過程：

　　接種S180腫瘤細胞于ICR系健康小白鼠腹腔1周左右，收集腹水細胞并稀釋，重懸于0.85％生理鹽水，調節細胞密度為1.0×10⁶cells／ml，同時臺盼蘭染色計數保證細胞存活率在99％以上。將細胞分裝在醫用一次性薄壁采血管中（1ml／管），并隨機分為對照組（CT）和不同超聲處理組（U），每組三管然后進行聲超處理，實驗至少重復三次以確認結果的可靠性。

　　采用頻率為2.2MHz聲照時間為60s，超聲強度分別為0、1、2、3、4、5、6、7W／cm²；采用聲照強度為3W／cm²，處理時間分別為0、15、30、45、60、90s作用于S180細胞。臺盼蘭拒染法檢測不同處理后細胞的相對存活率，臺盼蘭配成0.4％的染液，聲照處理后取部分細胞懸液用臺盼蘭染色后在光鏡下用血細胞計數板計數。細胞相對存活率計算公式：存活率＝實驗組拒染細胞數／對照組拒染細胞數×100％。

　　收集S180腫瘤細胞并稀釋調整細胞密度為1.0×10⁶cells／ml，分裝于一次性醫用采血管中（1ml／管）。將各管細胞隨機分為1個對照組和2個實驗組（不同聲照時間組），每組3管。其中對照組每管加50μl生理鹽水，各實驗組每管避光加入50μlFD500工作液（終濃度為10mg／ml），輻照實驗完畢，即刻離心收集細胞，用PBS反復洗滌，懸浮，高速離心以除凈細胞外FD500。流式細胞儀檢測熒光染色陽性細胞（FD500進入細胞）每個樣品檢測1.0×10⁴個細胞；同時熒光顯微鏡觀察熒光染色陽性細胞，至少觀察十個視野并以CCD捕捉圖像（×40）。

　　LDH釋放是細胞膜損傷的敏感指標之一，實驗完畢后，采用LDH試劑盒測定各組細胞膜的損傷程度，步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。計算公式：LDH活性（U／L）＝（測定空白管吸光度值－空白管吸光度值）／（標準管吸光度值－標準空白管吸光度值）×標準管濃度（2μmol／ml）×樣本測試前稀釋倍數。LDH單位酶活性定義為每毫升細胞懸液（1.0×10⁶cells）在本反應體系中使反應液中2μmol／ml2，4-二硝基苯肼轉化為丙酮酸二硝基苯腙所需的酶量。

　　熒光偏振法檢測細胞膜脂流動性，配制2×10^－3mol／mlDPH母液，于用前用PBS稀釋為標記膜脂的2×10^－6mol／mlDPH，37℃溫育30min，PBS洗滌四次后懸于4ml0.1mol／LPBS中，在激發波長360nm，發射波長430nm處測定熒光偏振度P，計算膜脂流動性LFU＝0.5－P／P²。

實驗結果：

圖1：不同超聲強度下各組細胞的相對存活率

　　1、超聲輻照最佳強度的篩選

當超聲輻照時間為60s，不同強度的聚焦超聲對S180腹水瘤細胞的殺傷作用如圖1所示。由圖1可看出隨著聲照強度的增加，U組細胞相對存活率下降趨勢明顯，反映出細胞受損程度不斷加深。超聲強度為1W／cm²時，U組細胞相對存活率為95.83％，當其強度增加至2W／cm²時，細胞存活率下降幅度有所增加（89.67％），而當超聲強度為3W／cm²，U組細胞相對存活率驟降至61.81％（P＜0.01）。當超聲強度大于3W／cm²時，細胞相對存活率均急劇下降，但其總體趨勢趨于平緩，當強度增加至7W／cm²時，存活率僅為2.38％，其損傷程度顯著上升。由此可見，輻照強度3W／cm²為超聲處理S180細胞的強度閾值，低于3W／cm²損傷程度過小，效果不明顯，高于3W／cm²細胞受損加重，可能無法完成自身修復，而導致細胞即刻溶解。結果表明3W／cm²的聚焦超聲是引發S180細胞膜損傷效應的最佳處理強度。

圖2：不同處理時間各實驗組細胞的存活率

　　2、不同超聲處理時間對細胞存活率的影響

超聲照強度為3W／cm²U組細胞存活率隨聲照時間延長而下降，超聲處理15s時，其細胞相對存活率（91.13％）較對照組差異不顯著（P＞0.05）；當超聲處理時間增加到30s時，其細胞存活率降至80.65％，與對照組相比差異較明顯（P＜0.05）；隨著聲照時間延長至60s時，細胞存活率較對照組差異極顯著（61.77％）；當輻照時間進一步增至90s時，細胞損傷程度大幅度增加（43.22％）。結果表明：超聲對細胞造成的損傷程度隨著輻照時間的增加而升高，且30s時細胞明顯受損，而60s則是超聲處理S180細胞的時間閾值，因此本實驗選用30s和60s作為輻照時間參數以進一步研究超聲引發的膜損傷的時效關系。

圖3：不同處理組S180細胞FD500陽性染色率

　　3、超聲對細胞膜通透性的影響

　　大分子熒光物質FD500，通常難以進入胞膜完整的細胞。研究表明熒光右旋糖酐（FITC）不黏附在細胞膜上且FD500極少進入死細胞，因此FD500進入活細胞而使其染色可作為膜孔形成的主要標志之一。采用流式細胞儀檢測FD500熒光染色陽性細胞對照組陽性細胞率僅為1.23％，而超聲輻照30s與60s的陽性細胞率分別為14.17％和18.65％。同時由熒光顯微鏡觀察各組細胞，發現：對照組幾乎分辨不出熒光現象；30s與60s處理組的熒光。強度則明顯增加。

　　安泰ATA-8202射頻功率放大器：

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