微流控技術(shù)是一種通過微小的通道和微型裝置對流體進行精確操控和分析的技術(shù)。它是現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)發(fā)展過程中的一種重要的生物醫(yī)學工程技術(shù)，具有廣泛的應用前景和重要性。它在高通量分析、個性化醫(yī)療、細胞篩選等方面有著巨大的潛力，Aigtek安泰電子今天就將為大家分享一篇微流控領(lǐng)域研究成果，一起接著往下看吧~

　　惡性腫瘤是全球人類第二大死亡原因。近期，在發(fā)達國家中，由它引起的死亡甚至經(jīng)已超過心血管疾病，使之成為發(fā)達國家的第一大死亡原因。實體瘤會在其周邊形成一個抑制環(huán)境，如營養(yǎng)耗竭，廢物積累，缺氧，pH值酸化等。這種環(huán)境會對人體的免疫系統(tǒng)造成極大的負擔，從而嚴重損害效應免疫細胞，如T細胞和自然殺傷細胞(NK)破壞腫瘤細胞的能力。

　　在過去的幾年里，免疫學方面的多項突破，如嵌合抗原受體(CAR)T/自然殺傷細胞(NK)和免疫檢查點抑制劑(ICIs)，在血液惡性腫瘤(如急性髓細胞白血病和急性淋巴細胞白血病)的治療中取得了巨大的成功(2)。因此，科學家和臨床醫(yī)生正在努力將免疫療法推廣到實體瘤的治療上。然而，驅(qū)動免疫抑制的具體分子機制，以及免疫細胞適應抑制環(huán)境的能力，尚不完全清楚，并且傳統(tǒng)的二維(2D)模型并不能很好的模擬三維實體瘤所形成的復雜的腫瘤微環(huán)境(TME)。

近期， University of Wisconsin的Jose M. Ayuso 與David J. Beebe聯(lián)合 Morgridge Institute for Research的Melissa C. Skala在Science Advances （IF=14.136)上發(fā)表題為Microfluidic tumor-on-a-chip model to evaluate the role of tumor environmental stress on NK cell exhaustion的文章。他們使用體外微流控芯片腫瘤平臺（圖1），實現(xiàn)了對乳腺癌實體瘤微環(huán)境中四個要素：營養(yǎng)、pH值、增殖和壞死的梯度模擬。通過對腫瘤細胞和免疫細胞的觀測，評估了NK細胞如何對腫瘤誘導的抑制環(huán)境做出反應。

　　首先，他們構(gòu)建了一個腫瘤微流控模型。該模型有一個中央微室，微室一側(cè)有一根PDMS小棒，其余部分則填入混合了乳腺癌細胞(即MCF7)的膠原水凝膠。小棒在水凝膠固化后被移除，形成管狀空腔。再在空腔內(nèi)壁鋪上一層內(nèi)皮細胞（人臍帶內(nèi)皮細胞HUVECs），并注入培養(yǎng)基，就形成了一個可向周邊輸送營養(yǎng)的類血管結(jié)構(gòu)（圖1B）。通過比較可以觀察到，距離類血管結(jié)構(gòu)越遠的乳腺癌細胞的活性和增值速率會逐步降低。

　　圖1腫瘤芯片

　　接下來，團隊在膠原水凝膠中同時均勻混入乳腺癌細胞（MCF7)和自然殺傷細胞（NK-92）來評估NK-92細胞在響應腫瘤芯片產(chǎn)生的環(huán)境時的分子變化。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)實驗和非分級聚類圖分析顯示，NK-92與免疫衰竭相關(guān)的多個基因，以及與營養(yǎng)饑餓、缺氧和血管生成相關(guān)的基因在培養(yǎng)一周后，表達量都出現(xiàn)顯著上調(diào)。這說NK-92在該環(huán)境下逐漸衰竭，并激活了一些適應性反應。而與NK細胞存活、增殖和激活相關(guān)的多個基因則顯著下調(diào)，突出了腫瘤芯片微設備內(nèi)部產(chǎn)生的環(huán)境的免疫抑制作用(圖2C)。通過從芯片不同部位取NKcell進行比較，團隊發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域的NK-92細胞的基因表達也大不相同。同近端區(qū)域相比，遠端區(qū)域的NK細胞增殖能力較弱，對趨化因子的反應較弱，但它們的促炎反應基因的表達程度卻出現(xiàn)上調(diào)。

　　那么NK細胞衰竭的現(xiàn)象到底是由微裝置中產(chǎn)生的環(huán)境應激引起的，還是僅僅是由于腫瘤細胞長達7天的慢性激活引起的呢？

　　圖2腫瘤芯片混入NK細胞培養(yǎng)引發(fā)NK細胞衰竭

　　為了回答這個問題，該團隊在養(yǎng)分充足的孔板里，重新培養(yǎng)混入了MCF-7的NK-92細胞并培養(yǎng)相同的時間。經(jīng)過同樣的基因表達檢測流程，他們發(fā)現(xiàn)此時NK-92的基因表達與培養(yǎng)在腫瘤芯片中的大相徑庭。于是可以得出結(jié)論，NK細胞衰竭的主要因素是環(huán)境壓力，而不是腫瘤細胞對NK的慢性激活。而這種區(qū)別，同時也體現(xiàn)了芯片腫瘤模型相對于傳統(tǒng)檢測模型的優(yōu)勢，驗證了模擬實體瘤微環(huán)境與否對實驗結(jié)果的準確性存在巨大的影響

　　圖3比較在微環(huán)境呈梯度變化的腫瘤芯片與營養(yǎng)供給充足的傳統(tǒng)三維培養(yǎng)環(huán)境中，NK細胞的耗竭狀況。

　　基因表達分析表明，腫瘤芯片模型較傳統(tǒng)孔板而言能觀察到更明顯的免疫耗竭，其中耗竭標記物PD-1和IDO-1的表達出現(xiàn)了大幅的上調(diào)。因此，團隊開始從應用角度評估該芯片，使用它來測試針對免疫衰竭的免疫療法的潛力。他們在芯片中加入抑制耗竭標記物表達的藥物，再對腫瘤細胞的成活率進行檢測，以表征NK細胞的免疫活性（圖4）。最終，實驗結(jié)果證明免疫調(diào)節(jié)因子如檢查點（ICIs）和代謝（IDO-1）抑制劑在一定程度上減輕了免疫衰竭。然而，完全根除位于腫瘤最內(nèi)層的腫瘤細胞可能需要針對腫瘤微環(huán)境效應的新方法。

　　圖4ICIs和IDO-1抑制劑在傳統(tǒng)檢測和腫瘤芯片上的作用

　　逆轉(zhuǎn)或防止免疫衰竭的新療法有很大的潛力，但人們對驅(qū)動這一過程的機制仍知之甚少。因此，該團隊進一步開始研究將這些出現(xiàn)耗竭現(xiàn)象的免疫細胞從受抑制的環(huán)境中移出，看它們是否還能恢復到原來的表型。于是在芯片中培養(yǎng)一周后，混有MCF-7和NK-92的膠原水晶膠被取出芯片腔室。NK-92細胞被分離出來后再轉(zhuǎn)移至環(huán)境壓力小的培養(yǎng)瓶里再養(yǎng)一周。觀察發(fā)現(xiàn)，幾個在腫瘤芯片培養(yǎng)細胞中逐漸上調(diào)的與免疫衰竭和應激反應相關(guān)的基因(如IDO-1、CCl28、VEGF和MICA)，在傳統(tǒng)燒瓶中培養(yǎng)1周后恢復到原來的值(圖5C)。這說明NK細胞在與腫瘤細胞共培養(yǎng)后可能還保留了一些原始細胞狀態(tài)的記憶。

　　圖5在腫瘤芯片平臺上培養(yǎng)過后，NK細胞的恢復

　　分析RT-qPCR的數(shù)據(jù)表明暴露的NK細胞與未暴露的NK細胞具有不同的分子表型。因此，該團隊還評估了暴露NK細胞中這些分子改變所帶來的功能層面的后果（圖6）。最終，實驗結(jié)果強調(diào)了芯片上腫瘤產(chǎn)生的環(huán)境壓力會顯著影響NK細胞的分子表型和功能。

　　圖6暴露前后NK細胞的功能變化

　　隨著科技的不斷進步，腫瘤芯片技術(shù)可能會加速各種新型的免疫療法的發(fā)展，為相關(guān)實驗提供一個多功能的工具，成為連接體外平臺和動物模型之間的橋梁。

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